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酵母雙雜交(Y2H)實驗操作指南

發(fā)布時間： 2024-03-21　　點擊次數： 2368次

酵母雙雜交系統(tǒng)(Yeast two hybrid，Y2H) 常用于分析兩種蛋白質的相互作用。將兩種蛋白質分別克隆到酵母表達質粒的轉錄激活因子的DNA結合結構域（DNA-BD）和轉錄激活域（AD）上，構建成融合表達載體，從而分析兩種蛋白質的相互作用。

pGBKT7是酵母雙雜交bait表達載體，旨在表達GAL4 DNA結合結構域（DNA-BD,1-147 aa）與bait蛋白質的融合蛋白質。pGADT7是酵母雙雜交表達載體，旨在表達GAL4激活結構域（AD, 768-881 aa）與目的蛋白質的融合蛋白質。

一、酵母感受態(tài)細胞制備
(1) 將-80℃保存的酵母菌株在YPDA固體培養(yǎng)基平板上劃線，30℃培養(yǎng)條件下倒置培養(yǎng)4-7d。
(2) 挑取單菌落至含3mLYPDA液體培養(yǎng)液中。
(3) 30℃培養(yǎng)，200rpm 震蕩培養(yǎng)8h。
(4) 當菌液OD值約為0.3時，轉移10uL菌液到含50mIYPDA培養(yǎng)液中。
(5) 30℃培養(yǎng)，200rpm震蕩培養(yǎng)16-20h至OD值為015-0.3。
(6) 700g轉速5min室溫離心收集細胞。
(7) 將底部沉淀使用已預熱至30℃的100mLYPDA中重懸酵母細胞。
(8) 30℃，200rpm，搖3-5h至OD值=0.6時。
(9) 5min室溫離心收集細胞。
(10) 將底部沉淀在30mL無菌超純水中重懸酵母細胞.
(11) 700g轉速5min室溫離心收集細胞。
(12) 將底部沉淀加入3mL的1.1XTE/LiAc重懸細胞。
(13) 將懸重懸細胞分成2管，6000g轉速室溫離心30s。
(15) 將底部沉淀加入500uL的1XTE/LiAc重懸酵母細胞，分裝為100uL每管。
二、轉化
（1）在干凈的1.5 mL的離心管中并振蕩混勻。
（2）每個離心管中加入100 µL的酵母感受態(tài)細胞，500 µL的PEG/LiAc溶液，加入兩種質粒，并且將管中的混合物進行旋渦振蕩，將其混勻。
（3）在30℃，220 rpm/min的搖床振蕩培養(yǎng)30 min。
（4）往每個離心管中加70 µL的DMSO，并溫和的上下顛倒混勻。將離心管在42℃水浴中熱激40 min（每隔10 min搖勻1次）。
（5）取出離心管，在冰上靜置2 min。
（6）吸取100 µL并涂布在相應的二缺固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3-4天，待菌長好后，挑單菌落于10ulYPDA液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)過夜。
互作驗證：
取過夜培養(yǎng)的菌液涂布于四缺平板上，將培養(yǎng)皿置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察是否生長與顏色變化。
注意事項：
（1）檢測感受態(tài)細胞效率，標準操作規(guī)范。
（2）注意質粒使用量，檢查儀器狀態(tài)。
（3）配制新鮮培養(yǎng)基，并做對照轉化，添加抑制劑，同時增設嚴格的對照組防止自激活。
（4）應挑選大的、新鮮的菌株克隆進行培養(yǎng)。
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