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細胞計數的實驗步驟＆問題分析
發布時間： 2024-04-25 點擊次數： 1647次細胞計數在細胞實驗中是非常常見的，大多數實驗室目前使用細胞計數板進行細胞計數，細胞計數板的結構如下圖所示：
實驗步驟
1.所用細胞密度達到一定要求后進行細胞計數鋪板，提前準備好細胞計數板、蓋玻片、計數器；
2.棄掉原有培養基，加入1ml溫浴的PBS緩沖液清洗；
3.棄掉PBS緩沖液，加入胰酶消化細胞，消化時間根據細胞類型及日常經驗決定；
4.消化相應時間后，加入二倍體積的培養基終止消化，用移液器將細胞全部吹下，轉移至離心管內；
5.離心機室溫800rpm,離心5min；
6.準備和所計數細胞種類相同的1.5ml Ep管，各加入PBS緩沖液980ul備用；
7.準備細胞計數板，并在計數區蓋上蓋玻片；
8.將5中離心結束的細胞棄上清，加入1ml培養基，充分混懸后取20ul加入到6中的Ep管中，充分顛倒混勻后取12ul加入牛鮑計數板一側的計數區內，保證計數區充盈。
9.低倍顯微鏡（物鏡4）下找到計數視野，上圖中“"B C D E“"區為細胞計數區。
10.高倍鏡（物鏡10）下計數細胞，依次計數4個方格內的細胞數量。
11.計算細胞數量，假設4個方格內細胞總數為A,則每ml的細胞數量為：A/4×104×50（稀釋倍數）=B個。
12.假設鋪板所需細胞密度為1×104個/ml，則所需8中的細胞混懸液的量為：1×104×C（培養基所需毫升數，如6孔板每孔加培養基2ml）/B=D ml，最后換算成μl即可。
13.鋪板：取C ml培養基，加入8中細胞混懸液D μl，充分混勻后依次加入培養皿中，放入細胞培養箱內即可。
常見問題及注意事項 1.鏡下計數細胞時，壓線細胞按照“計上不計下，計左不計右"的原則進行，若有少量成團細胞，則按1個細胞處理，若成團細胞太多，說明在步驟8中，細胞不全部混懸，未能所有都分開成單細胞，因此需重新進行上述步驟。 2.需要鋪板的細胞長滿時數量較多，因此計數時稀釋倍數盡量大，取混懸液的每一步保證細胞充分混勻，計數結果更為準確。 3.鏡下計數細胞時，最少計數兩次，取平均值為最終結果。 4.細胞混懸液加入細胞計數板時，建議使用10μl小槍頭、2-20μl移液器，槍頭傾斜抵住蓋玻片邊緣，緩慢加入，務必保證細胞混懸液全部加入，計數區充盈。
關于細胞計數，以如下實例來充分理解上述計算過程：
1.假設實驗要求最后鋪板密度為1×105個/ml，計劃以6孔板鋪板，擬使用4個孔，每孔2ml培養基，則所需細胞總數為：1×105×2ml×5孔=1×106個。 2.假設4孔細胞總數為100個，則細胞密度為：100/4×104×50（稀釋倍數）=1.25×107個/ml。 3.最終所需細胞懸液量為：1×106/1.25×107=0.08ml=800μl 4.鋪板：培養基5孔（為防止不夠所以多準備1孔）2ml×5孔=10ml加入細胞混懸液800μl，混勻加入六孔板即可。
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