在生物醫學實驗中，細胞培養是基礎中的基礎，大部分實驗只需要用到相關細胞系的培養，但對實驗動物原代細胞的培養也是非常重要的。脾臟T細胞的分離和培養就是免疫學領域的一種非常基礎和重要實驗方法。本文將詳細探討小鼠脾臟T細胞分離培養的關鍵步驟，幫助大家更有效地進行實驗操作。

一、實驗目的

提取小鼠脾臟的naive CD4+ T細胞，研究某種因素對naive CD4+ T細胞或某一亞型的CD4+ T細胞增殖分化和功能狀態的影響，或者在誘導分化為CD4+ T細胞的某一亞型后做下游實驗。

二、實驗內容

小鼠脾臟naive CD4+ T細胞的分離和原代培養

三、實驗條件

動物房超凈臺、細胞房超凈臺

四、實驗設計原理和方法

原代細胞的培養實驗中，無菌分選是關鍵。磁珠分選（MACS）和流式分選（FACS）是最經常使用的兩種分離特定細胞的方法。

流式分選可以有以下特點：

1.實現單個細胞的分選

2.同時分選多種細胞

3.可以基于細胞表面標志物表達水平進行分選

4.可以基于細胞內標志物進行分選

5.可以分選由多個標志物復雜組合的細胞類型

磁珠分選是基于細胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性單抗結合，在外界磁場中與抗體結合的細胞被吸附而滯留在分選柱內，而缺乏該表面抗原的細胞則不能在分選柱內停留。分為陽性分選（磁珠結合的細胞是目的細胞）和陰性分選（磁珠結合的細胞是非目的細胞）兩種分選策略。

與流式分選相比，磁珠分選更簡便更快捷，是分離常見細胞類型的第一選擇。在樣本量較大或分選稀有細胞類型時，先磁珠分選后流式分選的方案能夠顯著提高分選的效率。

五、實驗材料

（一）10cm培養皿、PBS、75%酒精、24孔板、手術器械（兩套）

（二）STEMCELL磁珠分選儀器、磁珠分選磁力架、分選柱、70um細胞濾網、裂紅液

六、實驗步驟

（一）取脾（動物房超凈臺）

1.將小鼠脫頸處死，用75%酒精浸泡一分鐘后放入10cm培養皿中準備解剖，使用不同的小鼠品系可能會影響產量和性能。例如，來自C57BL/6小鼠的細胞更好地產生Th1細胞，而來自Balb.c小鼠的細胞更好地產生Th2細胞。；

2.第一套器械用于剪開分離皮膚肌肉，暴露出足夠的視野時，換用第二套器械用于取脾。之后處理每一只小鼠時，第一套和第二套器械都不要混用；

3.取出的脾放入裝著PBS的24孔板中。

（二）制備單細胞懸液（細胞房超凈臺）

1.將脾臟放在70um細胞濾網上，研磨并加入5ml PBS（一個脾臟用5ml）過濾，過濾至15ml/50ml離心管中，這一步建議過濾兩次，否則會在后續離心時形成富含纖維的沉淀，棄置此沉淀又會浪費很多細胞；

2.600g離心5min，棄上清。每個脾臟5ml/10ml裂紅液重懸，室溫裂紅5min，加入2ml/4ml PBS（與裂紅液體積對應）終止；

3.600g離心5min，棄上清。每管脾臟取1-2ml PBS重懸，從中取出100ul依次稀釋成10倍和100倍；

4.從10倍和100倍稀釋液中取出10ul放入細胞計數板，進行計數。

（三）磁珠陽性分選（細胞房超凈臺）

磁珠分選大致分為三個步驟：潤洗（用分選buffer潤洗分選柱）、過濾（多次重復過濾細胞懸液）、洗滌（用分選buffer洗滌柱子，使細胞洗脫）。

（四）T細胞分化培養基制備（細胞房超凈臺）

1.磁珠分選前一天（也就是Day0）準備培養板，加入250ul anti-mouse CD3（2 µg/mL或3 µg/mL，用PBS稀釋），37℃孵育2小時或4℃過夜包被。

2.配置T細胞基礎培養基（50ml）：48.5ml的1640（血清）細胞培養基、0.5ml HEPES、0.5ml GlutaMAX、0.5ml丙酮酸鈉、50ul 2-ME；

3.重懸分裝各類細胞因子，最終濃度為10ug/ml，于-20℃保存；

4.配置各種分化培養基（用24孔板進行分化培養，每個孔加入1ml培養基）

（1）Th1：10ml基礎T細胞培養基，加入10ul IL-2，10ul IL-12，10.3ul IL-4抗體；

（2）Th2：10ml基礎T細胞培養基，加入10ul IL-2，10ul IL-4，11.5ul IFN抗體；

（3）Treg：10ml基礎T細胞培養基，加入10ul IL-2，10ul TGF-β；

（4）Th17：10ml基礎T細胞培養基，加入10ul IL-2，2ul TGF-β，20ul IL-6，10ul IL-1β，10.3ul IL-4抗體，11.5ul IFN抗體；

（以上培養基在4℃僅能保存一周）

5.每1ml細胞懸液（10^6個細胞）加入25ul CD3/CD28磁珠，振蕩混勻。不論任何分化體系都需要有CD3/CD28/IL-2的參與，這3者是T細胞增殖的基本功能抗體和細胞因子；

6.將分選出的naive CD4+ T細胞離心，按照你想要研究的亞型分成不同部分，用各自的分化培養基重懸，以10^6個細胞/1ml加到24孔板中培養

7.Day2.3 僅觀察；Day 4 直接在原孔中補充分化培養基；Day5 僅觀察；Day6 收取細胞，通過流式檢測分泌的細胞因子的水平，進行后續實驗。

以上就是本期的內容，更多資訊，歡迎點擊安培生物網站鏈接了解更多技術與產品資訊。

安培生物致力成為推動生命科學進步值得信賴的合作者

深圳/湛江安培生物科技有限公司,是一家具有核心的技術實力、先進的經營管理水平和完善的市場銷售體系的生物高科技企業?？偛吭O在廣東，服務面向全國。安培生物集進口試劑、實驗室耗材銷售、技術服務與合約開發為一體的專業化高科技公司，旨在為生命科學的發展提供較好的產品與服務。本公司建立了涵蓋分子生物學、細胞生物學、免疫學、信號傳導和神經科學等領域的產品供應線，在各個領域內向用戶提供較高的水平和質量穩定的產品，安培生物致力于為廣大的科研機構、高等院校等客戶提供各種產品、技術支持與服務。

可以在第一時間為用戶提供比較先進的專業資訊和完備的產品和物流服務。 專業的技術力量使得我們能夠為廣大用戶提供強大的技術支持，深厚的人脈資源使得我們在全國主要城市擁有眾多的合作伙伴，安培生物非常榮幸能將世界上先進的高科技產品推薦給國內從事生物學領域科研的老師和同仁。作為專業性的產品供應商，公司出資存備了大量現貨，配合優秀的銷售隊伍以及專業的技術支持，隨時為客戶提供服務。