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小鼠骨髓細胞染色體標本制作實驗
發布時間： 2024-01-18 點擊次數： 1293次實驗原理：
在小鼠骨髓細胞中，有絲分裂旺盛，因此可以直接得到中期細胞而不必像血淋巴細胞那樣要經過體外培養。骨髓細胞具有高度的分裂活性，經秋水仙素（秋水仙堿）處理后，使分裂細胞阻斷在有絲分裂中期，再經低滲處理、固定、滴片、染色等步驟，可制作較好的骨髓細胞的染色體標本。通過骨髓得到染色體是比較簡便的，一般也無需無菌操作。在臨床上多用于白血病的研究，在實驗條件下，這種染色體是機體內真實情況的反映，而且用骨髓制片的方法易于觀察毒性物質在體內對細胞和染色體的影響。
實驗方法和步驟：
(一)秋水仙素處理取骨髓前3-4h先給小白鼠經腹腔注入0.1％的秋水仙素，注射劑量為4mg／kg動物體重。
(二)取骨髓經秋水仙素處理的小白鼠，可用損傷脊髓法（斷頸法）迅速處死，然后用剪刀剪開大腿上的皮膚和肌肉，取出大腿骨和脛骨，用一小塊紗布來回搓干凈附在骨上的肌肉33碎渣。剪掉股骨兩端膨大的關節頭，然后將股骨剪碎投入小燒杯中，用2毫升1％檸檬酸鈉溶液攪爛碎骨，使骨髓細胞游離出來。靜止片刻，用吸管把懸浮液吸到離心管中，可重復沖洗一次。此時離心管中的細胞懸浮液可達4-5毫升。
(三)低滲將所獲得的細胞懸浮液先進行平衡(注意：每次離心前都要平衡)，然后以1000rpm離心10min，吸去上清液，留0.2ml沉淀物，加0.075M KCL溶液至8毫升刻度，將細胞沉淀物吹散打勻，在水浴37℃低滲20-30min。
(四)固定低滲處理后的材料，以1000rpm離心10min，吸去上清液，留0.2ml沉淀物，用吸管吹散沉淀物，沿管壁加固定液至6毫升,沖勻后靜止固定20min，即第一次固定。按上述條件離心，去上清液，再次加入固定液至6ml，進行第二次固定。20min后離心吸去上清液，留0.2ml沉淀物,再往沉淀物中滴加4滴固定液，沖勻制成細胞懸液。
(五)滴片取事先在冰箱中預冷的載玻片(載玻片須經硫酸洗液浸泡10天以上，經清水沖洗，用蒸餾水浸泡)，滴2-3滴細胞懸液于粘有冰水的載玻片上，用嘴吹氣，使細胞迅速分散。將載片插放在切片架上晾干。
(六)染色取2張制片平放在玻璃板上，用10：1 Giemsa染液染色20min，流水沖洗后晾干即可鏡檢（也可以使用苯酚品紅溶液染色）。
(七)觀察用中倍鏡選擇分散適度，不重迭的染色體分裂相，轉高倍鏡詳細觀察小白鼠染色體的形態特征，并計算2n的染色體數目。
觀察細胞的標準：
1、細胞完整，輪廓清晰，染色體分布在同一水平面上。
2、染色體形態和分布良好。
3、最好無重疊，即使有個別重疊，也要能明確辯認，以免差錯。
4、觀察的細胞處于同一有絲分裂階段，即染色體螺旋化程度或染色體長短大致一樣。
5、在所觀察的細胞周圍，沒有離散的單個或多個染色體存在，以免影響計數。
注意事項
1.提前3-4小時注射秋水仙素，時間太長或者太短都會影響染色體中期的數目和形態。
2.在低滲過程中，時間和吹打都很重要，低滲過渡會導致染色體膨脹，染色后肥胖，低滲時間不夠，染色后染色體顏色深，看不出條帶。
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