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從哺乳動物細胞中制備核和細胞質(zhì)提取物

發(fā)布時間： 2023-01-06　　點擊次數(shù)： 1474次

材料與儀器
轉(zhuǎn)瓶或單層培養(yǎng)的哺乳動物細胞（如HeLa細胞）
PBS 低滲緩沖液高鹽緩沖液含1. 2 mol L KCl 透析緩沖液液氮
貝克曼 JS4. 2 轉(zhuǎn)子或相當?shù)霓D(zhuǎn)子 50 mL 圓錐形刻度聚丙烯離心管（對較小體積的提取物也可用 15 mL 的離心管） Dounce 氏玻璃勻漿器（B 型研杵） Beckman JA-20 離心轉(zhuǎn)子或相當?shù)霓D(zhuǎn)子磁性攪拌器或傾斜臺 Beckman JA-20 離心轉(zhuǎn)子或相當?shù)霓D(zhuǎn)子磁性攪拌器或傾斜臺、管型透析膜（14000 MWCO）、電導(dǎo)計
步驟
1a) 收集轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的細胞：將 5× 108?10× 108 細胞置 1 L 的塑料瓶 1850 g 離心 20 min。輕輕倒去上清并丟棄，將細胞轉(zhuǎn)入50 mL 錐形刻度離心管中（每管 2?3 L 培養(yǎng)液中的細胞）。進行步驟 2。

1b) 收集單層培養(yǎng)的細胞：單層細胞長滿后去掉培養(yǎng)液。用足量 PBS 洗 1 次，PBS 用量為沒過細胞，輕輕振蕩，棄 PBS。將細胞刮入新鮮 PBS 液里，倒進錐形刻度離心管中。進行步驟 2。

2) 1850 g 離心 10 min。進行步驟 3a 轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)或步驟 3b 單層培養(yǎng)。

3a) 轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)細胞：輕輕倒出上清并棄掉。用離心管上的刻度測量壓緊后細胞的體積 (Pcv)將細胞重懸于約 5 倍于其 pcv 的 PBS 液中。1850 g 離心10 min。進行步驟 4。

3b) 單層培養(yǎng)細胞：輕輕倒出上清并棄掉。用離心管上的刻度測量 pcv, 進行步驟 4。

4) 快速地將沉淀的細胞重懸于 5 倍體積的低滲緩沖液中1850 g 離心 10 min 并棄掉上清。

5) 將細胞沉淀重懸于 3 倍于原 pcv 的低滲緩沖液中，放置在冰上 10 min，讓細胞腫脹。

6) 將細胞轉(zhuǎn)到 Dmmce 氏玻璃勻漿器中，用 B 號研杵上下抽提 10 次。用臺盼藍染色排斥法在顯微鏡下檢査細胞裂解情況（應(yīng)大于80%?90%)。

7) 將細胞轉(zhuǎn)到離心管中。用 JS4.2 轉(zhuǎn)子 3300 g 離心 15 min 收集細胞核。保留上清用來制備 S-l00 細胞質(zhì)提取物。

8) 用離心管上的刻度測量第 7 步離心壓緊后的細胞核體積（pnv)。用 l/2 pnv 體積的低鹽緩沖液重懸細胞核。

9) 在輕輕攪拌的同時，逐滴加入1/2 pnv 體積（見步驟 8) 的高鹽緩沖液。必要時用 Dounce 氏玻璃勻裝器混勻。

10) 不斷輕輕攪拌 30 min 以提取核內(nèi)容物。

11) 用 Beckman JA-20 轉(zhuǎn)子 25 000 g 離心 30 min 以收集核提取物。倒出上清并測量其電導(dǎo)率（見步驟 12)，這就是核提取物。

12) 將核提取物加入透析管中，用夾子至少封住透析袋的一端；透析袋一端是打開的，這樣就可以測量透析袋內(nèi)核提取物的電導(dǎo)率，比較核提取物電導(dǎo)率和透析液電導(dǎo)率的不同，以確定是否需要進一步透析。在 50 倍體積的透析液中進行透析，直到提取物的電導(dǎo)率和透析液一致為止（即提取物的 KCr 濃度達到 100 mmol/L 時）。盡量縮短透析時間。

取 5?10 μl 提取物用水稀釋至 1 mL 用來測電導(dǎo)。用電導(dǎo)測量儀直接讀出稀釋液的電導(dǎo)值，與同樣稀釋的透析液的電導(dǎo)值相比較。

13) 將提取物從透析袋中移出，最后一次檢測其電導(dǎo)率以確定透析已經(jīng)完成。將提取物25000 g 離心 20 min, 棄掉沉淀。

14) 測定上清中蛋白質(zhì)濃度。根據(jù)需要分裝，浸入液氮中速凍，-80℃保存。
注意事項
所有步驟的操作均在0?4℃進行，在冷室內(nèi)操作更好。緩沖液和設(shè)備要預(yù)冷。所有離心均在4℃進行，轉(zhuǎn)子要預(yù)冷。

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