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復蘇凍存細胞實驗
發布時間： 2022-12-06 點擊次數： 1494次原理
快速復蘇細胞，緩慢稀釋，以高細胞密度重新接種。
材料與儀器
步驟
材料
無菌
培養瓶（如果需要離心時）
生長培養基
吸量管，1ml，10ml
注射器和19號針頭（如果你使用玻璃凍存管）
非滅菌
保護性手套和面罩
37℃無菌水，10cm深，盛于清潔、用乙醇擦拭過的帶蓋的水桶中
鑷子
70%乙醇
棉簽
1%萘黑（酰胺黑）或0.4%臺盼藍
操作步驟
1.檢查凍存目錄，確定將要復蘇的凍存管的位置
2.收集所有材料，準備培養基，標記培養瓶
3.從凍存罐中取出凍存管，檢查標簽，確定是否是所需要的凍存管，若小管未浸沒在液氮中，將小管放入塑料除菌水桶內37℃的燒杯中。盡可能避免水沒過官帽，因為會增加污染的機會。
安全提示
將凍存管從液氮中取出時，必須穿實驗衣，戴手套。若凍存管浸沒在液氮中，則必須待面罩或護目鏡，也必須穿實驗衣戴手套。儲存在液氮中的凍存管，包括塑料小管都可能吸入液氮，復蘇時將可能發生劇烈爆炸。該種情況下，必須使用帶蓋的塑料水桶進行復蘇，以控制-爆-炸。
4.當凍存管復蘇時，再次檢查標簽以確定為所需的細胞；隨后用70%乙醇徹-底擦洗凍存管，然后在超凈工作臺內打開凍存管，
5.用1ml吸管將凍存管內含物轉移至培養瓶中。
6.將培養基緩慢的加至細胞懸液中:以每2min 10ml的速率進行滴加。開始時逐滴加入，然后可加快，逐漸稀釋細胞和細胞保護劑。
對于需要通過離心去除細胞保護劑的細胞：
（a）按照步驟6，在離心管或常規容器內緩慢稀釋細胞。
（b）100g離心2min。
（c）棄去含有細胞保護劑的上清培養液。
（d）以新鮮培養基重新懸浮細胞。
（e）接種入培養瓶。
7.凍存管內殘留物可用萘黑或臺盼藍染色，以測定細胞的存活率。
8.24h后檢查：
（a）對于貼壁單層細胞，依據預測密度（個細胞/cm2)的細胞照片，確認細胞是否貼壁，估計細胞存活率。
（b）對于懸浮生長的細胞，檢查外觀（清晰的細胞質，缺乏細胞顆粒），稀釋至常規的接種濃度。若進行細胞技術，并估計細胞存活率后，接種濃度可能更精確，這種情況下， 可以將細胞稀釋至常規存活細胞接種濃度。注意事項
1. 將凍存管從液氮中取出時，必須穿實驗衣，戴手套。若凍存管浸沒在液氮中，則必須待面罩或護目鏡，也必須穿實驗衣戴手套。儲存在液氮中的凍存管，包括塑料小管都可能吸入液氮，復蘇時將可能發生劇烈爆炸。該種情況下，必須使用帶蓋的塑料水桶進行復蘇，以控制-爆-炸。
2. 塑料凍存管在使用前要仔細檢查，以防管壁破裂或螺口不配套造成密封 不嚴。
3. 用DMSO作為凍存保護劑時，用前應先將凍存液在4℃預冷，解凍后應馬 上洗去保護劑。
常見問題
1. 檢查細胞活率。用1ml培養液重懸細胞，臺盼藍染料排除法檢查細胞存活率。
2. DMSO有-劇-毒，使用時要特別注意。此外，在凍存前越晚加入細胞越好，解凍后要盡快除去，以避免對細胞的毒害。
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