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原代角質形成細胞的分離培養(yǎng)方法

發(fā)布時間： 2022-10-25　　點擊次數(shù)： 1695次

為什么越來越多的生物實驗開始使用原代細胞？

原代細胞在相關細胞實驗使用過程中越來越多，人們不再單單趨于使用細胞系進行實驗研究，因為細胞系常常由于體外長期培養(yǎng)，而容易丟失原有的生物學特性，對藥物處理的反應差距越來越大。
原代細胞剛從組織中分離開，生物學特性未發(fā)生很大變化，仍保留原來的遺傳特性，也*為接近和反應體內生長特性，原代細胞的活力和生長狀態(tài)都比較好，細胞的純度和基因保留可達到90%以上，適宜用于藥物敏感性試驗、細胞分化等試驗研究，使用原代細胞進行實驗，可以獲得更準確的研究和數(shù)據(jù)。

角質形成細胞

角質形成細胞是一種不斷分化的復層鱗狀上皮細胞，其分化的最終階是形成角蛋白。根據(jù)角質形成細胞的發(fā)展階段和特點，從內向外可將其分為五層?；准毎麑佑址Q生發(fā)層，棘細胞層，顆粒層，透明層，角質層。

角質形成細胞的分化成熟表現(xiàn)為從基底層到向角質層的逐漸移行。在單一移行過程中，角質形成;細胞的形狀和功能也逐漸發(fā)生著變化，從單層柱狀上皮的基底層到扁平的細胞核消失的角質層。
新生的基底細胞進入棘細胞層，然后上移到顆粒層的最上層。細胞組織來源于實驗動物的正常皮膚組織，細胞生長狀態(tài)為貼壁培養(yǎng)。

需要的實驗試劑

1.培養(yǎng)基1：iCell原代角質細胞培養(yǎng)體系
4.基礎培養(yǎng)基：DMEM/F12
5.緩沖液：無菌不含Ca2+和Mg2+的1×PBS+1×P/S，pH=7.4
6.消化液1：1.2U/ml的dispase Ⅱ
7.消化液2：0.25%胰蛋白酶+0.02mM EDTA
8.消化液3：0.1%Ⅰ型膠原酶
9.75%醫(yī)用酒精
10.胎牛血清（FBS）

實驗器械

1.培養(yǎng)皿
2.T-25細胞培養(yǎng)瓶
3.100目不銹鋼網(wǎng)篩
4.200目不銹鋼網(wǎng)篩
5.眼科剪
6.眼科鑷
7.離心管（15ml、50ml）

實驗步驟

1.新鮮的包皮組織，裝盛于含有無菌生理鹽水或1×PBS的無菌容器中，于保溫盒中，冰上放置離體6h內運輸?shù)綄嶒炇疫M行后續(xù)分離。
2.在無菌環(huán)境中取出包皮組織，用1×PBS清洗2-3次去除表面血液后，75%的酒精浸泡100s
3.酒精浸泡組織后快速將組織轉入裝有1×PBS的培養(yǎng)皿中震蕩清洗數(shù)次以去除酒精，然后用眼科剪小心剪去皮下組織（脂肪，微血管等）
4.將去除了脂肪和微血管組織的再用1×PBS清洗幾次后，剪成3mm*8mm左右的皮片，用消化液1 4度消化過夜（15-18h）。
5.第二天，用2個眼科鑷子小心撕開過夜消化的皮膚組織，分離真皮和表皮；
6.分離的表皮用眼科剪剪碎后用消化液3 37度水浴消化1h。
7.消化完成后用移液器充分吹打100次左右，然后用含血清的培養(yǎng)基終止消化，過200目不銹鋼網(wǎng)篩后取濾懸液，轉入15ml離心管中，400g離心10分鐘，離心完成后棄去上清，沉淀用3ml的1×PBS吹打重懸后，400g離心5min離心完成后棄去上清，沉淀用2ml的原代角質細胞培養(yǎng)基吹打重懸后，轉入已經(jīng)裝有2ml培養(yǎng)基的T-25培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶置于37℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

8.視細胞貼壁情況48-72h后換液去除未貼壁的細胞，之后繼續(xù)培養(yǎng)，視細胞生長狀況和培養(yǎng)基顏色每2-3d換液一次；待細胞貼壁率達到80-90%后，進行常規(guī)傳代擴增操作（角質細胞對胰酶不太敏感，消化時間可能會增加到10-15分鐘，有時需要配合使用無菌細胞刮鏟進行傳代）。

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