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如何進行蛋白樣品的制備？要注意些什么？
發布時間： 2022-02-15 點擊次數： 2730次蛋白樣品的制備是蛋白質組研究的第一步，無論后續采用怎樣的分離或鑒定手段，樣品制備都是關鍵步驟。因此，為了*分析所有的細胞內蛋白，組織與細胞必須進行有效的破碎。本文在此介紹幾種較為常見的方法。
變性條件——SDS LB直接裂解：
用常溫或者高溫預熱過（預熱更有利于阻止蛋白水解或者磷酸酶去磷酸化，但容易遺忘，而LB久煮會改變某些性質）的1*SDS LB（或者略高1.5*）直接加到細胞或者組織上并煮樣。
通常6孔板細胞80%以上密度，需200ul，其他按平板面積比類推。通常條件下，SDS LB都是過量的（因此不一定要嚴格參考SDS LB稀釋比）；如果SDS LB不夠，樣品核酸、蛋白濃度過高時，煮樣后會發現tip吸不上來，非常粘、一砣一砣的，很容易堵住tip。
這時候常規做法有兩種：
1.再煮5min。常規煮樣時間3-5min，樣品過濃時就煮10min；
2.如果10min煮樣后，仍然吸不起來，才適當增加SDS LB，繼續煮；也可以對樣品進行超聲。煮樣時間若過長，蛋白會凝固，此時以失去繼續WB的意義，請丟棄（判斷標準：出現明顯的蛋白沉淀和水分層）
此方法的缺點是：SDS LB煮過的樣品如果用來做IP，需要特殊方法，因此，這種制備方法制備的樣品有使用局限。
非變性裂解法：
裂解細胞請盡量冰上操作，減緩酶解作用。
裂解液配方是：20mM Tris/HCl, pH7.6, 100mM NaCl, 20mM KCl,1.5mM MgCl2, 0.5% NP-40 and protease inhibitors (20μg/ml leupeptin,10μg/ml pepstatin A and 10 μg/mlaprotinin)（此裂解液可用于抽提核蛋白），其中蛋白酶抑制劑可用0.5mMPMSF替代；如果還要做磷酸化蛋白，加1mM Na3VO4（現加現用），10 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 50 mMbeta-GP。
此方法的優點：NaCl濃度略低于生理狀態，保證裂解細胞的方式較為溫和，便于隨后的IP等試驗。其他Na鹽濃度的細胞裂解液也很常見，諸如0.15M（生理鹽濃度）、0.3M、0.6M（高鹽系列，裂解細胞時染色體會析出，細胞碎片和沉淀非常粘稠）及0.8-1.2M；0.3M及以下適合 IP試驗，0.6M及以上適合純化蛋白，尤其相互作用較強的復合體，要得到純化的一些復合體的組成蛋白一般采用（木及）端的高鹽裂解細胞。
組織塊裂解：
組織塊較大用勻漿的方法最合適，現在有不少轉頭很小的勻漿器。
當組織超微量的時候，比如50mg新鮮癌組織，建議采用的方法是
1. 低溫（剪）攪碎，成肉糜狀。
2. 錫箔紙包裹好，放入少量液氮，快速敲擊（控制力量，盡量避免弄破錫箔紙），進一步破碎；反復多次。
3. 用上述細胞裂解液回收。
分泌型蛋白富集：
用無血清培養基培養細胞，收集上清液用于WB檢測；如果含量過低，需要用TCA沉淀富集。
理論上，從普通培養基中收集分泌蛋白，此時對細胞生長條件的影響最小，是最佳的實驗條件；但是這存在隱憂。因為含血清的培養基中含有非常豐富的BSA（牛血清白蛋白）之類的蛋白質，除非你進一步分離純化，否則直接用這種樣品去WB會有非常大的麻煩，尤其當你的蛋白在60-46kDa之間的時候；用“任何"抗體去檢測這一區間的蛋白，都會有一片非常強的信號。因為此區間蛋白（主要是BSA）濃度過于富集，會非特異性粘附“任意"抗體，從而最終被識別。同理，采用SDS LB裂解細胞制備樣品前，通常要用PBS洗滌，其目的之一是去除培養基中的BSA。
采用無血清培養基收集細胞上清除了改變細胞的生理狀態外（可能激活未知信號途徑，諸如AKT等），還會出現的問題是：
1. 即使采用了無血清收集上清，仍然有大量雜蛋白，但相對好很多。
2. 選用了上清，由于蛋白濃度太稀，通常要采用TCA沉淀富集，再重新溶解。
a. TCA沉淀對半定量操作要求非常高，因為很容易沉淀不充分或者離心操作丟失，尤其在離心過程，離心管的擺放非常講究，要180度翻轉離心兩次。
b。重新溶解時，由于蛋白需要在一定的鹽離子條件下才能重新溶解，你要摸索充分溶解的條件，相對麻煩。
實際上，如果你不是非常強調蛋白的分泌有什么生理功能，一般不建議檢測上清，尤其半定量的WB實驗檢測不同樣品間的差異。
注意事項 
樣品制備完，應立即低溫保存【-20度短期（幾天）；-80度長期；例如，IP用樣品應直接進行IP，避免凍融破壞蛋白質間弱的相互作用】。SDS LB煮沸過的樣品凍融會存在另一個問題，SDS沉淀；SDS在4度就會沉淀，何況-80度。上樣前應加熱充分溶解，否則從加樣口向下拖帶（SDS LB不夠，樣品未充分溶解也會出現類似拖尾；上樣過大也會）。
在樣品制備過程中，另一個需要注意的問題是，從樣品制備的起始階段就要注意定量問題；WB本身系統誤差有20%，太細微的差別經常忽略不計。細胞樣品可以先計數再接種，短時間內即使細胞生長有差異也不會對WB結果影響太多。組織樣品，從腫瘤組織的大小（稱重）開始，裂解液的體積都是精確定量的，操作過程也 盡量避免蛋白損失。
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