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從96孔微培養板生長的哺乳動物細胞中分離DNA
發布時間： 2021-12-20 點擊次數： 1438次原理
本方案由 Ramirez-solis 等的方法 1992，1993 改進而成，是一種從微培養板的每個孔生長的真核細胞抽提基因組 DNA 的簡便有效的方法。每個孔產生的基因組 DNA 足以做數次聚合酶鏈反應（PCR) 或者一次 Southern 雜交。對于制備用于 PCR 反應的基因組 DNA 的最佳方法。
材料與儀器
限制性內切核酸酶 無 DNase 的 RNase 細胞
細胞裂解緩沖液 乙醇 NaCl 乙醇溶液 磷酸鹽緩沖液 蔗糖凝膠上樣緩沖液 TE
抽氣設備 多通道移液器 溫箱 振搖平臺 Tupperware 容器步驟
一、材料
1. 緩沖液和溶液
細胞裂解緩沖液（10 mmol/L Tris-Cl (pH 7.5)，10 mmol/L NaCl，0.5% (m/V) Sarkosyl）
乙醇
NaCl/乙醇溶液
磷酸鹽緩沖液（PBS )
蔗糖凝膠上樣緩沖液
TE (pH 8.0)
2. 酶和緩沖液
限制性內切核酸酶
無 DNase 的 RNase
3. 專用設備
與帶閥門的真空管相連的抽氣設備
多通道移液器，8 或 12 道
溫箱，預設至 60℃。
振搖平臺
Tupperware 容器
4. 細胞和組織
在 96 孔微培養板上生長的細胞
二、方法
1. 用藍色尖頭或者巴斯德移液管吸去 96 孔培養板每個培養孔中的培養液。
只要小心不接觸細胞層，通常不用毎個培養孔換新的尖頭。
2. 每個培養孔中的細胞用 100 μl 磷酸鹽緩沖液沖洗 2 次。
3. 用多通道移液器在微培養板的每個孔中加入 50 μl 細胞裂解液。將數張濕的吸水紙置入一個聚丙烯盒中（如 Tupperware 盒)，再將盛有細胞裂解液和細胞的微培養板放在吸水紙上，用蓋封嚴盒子。
4. 將封好的盒子在 60℃ 溫箱中溫育 12~16 h。
5. 將盒子移出溫箱，取出培養板平放在工作臺上，冷卻數分鐘，每孔加入 100 μl NaCl/乙醇溶液。不用混勻，直接將培養板于室溫溫育 30 min。溫育末期應見到纖維狀的核酸沉淀。
6. 緩慢地倒轉培養板，將乙醇溶液倒入水池。核酸沉淀應黏附在培養孔的底部。將每個培養板倒置于干燥的吸水紙上，使殘余乙醇從培養板流出。
7. 每孔加入 150 μl 70% 乙醇，小心不要移動核酸沉淀。按步驟 6 倒轉培養板以去除 70% 乙醇。在吸水紙吸去多余的液體。用 70% 乙醇再沖洗沉淀 2 次。
8. 使培養板在室溫干燥直至最后的乙醇揮發。如果基因組 DNA 將用于 PCR 分析，進行步驟 9。如果 DNA 將用于 Southern 雜交，進行步驟 10、11 和 12。
9. 每孔加入 30~50 μl TE ( pH 8.0), 室溫緩和地震搖 12~16 h 使 DNA 溶解。
10. 如果 DNA 將用于 Southern 雜交，制備下列限制性內切核酸酶混合物；每孔需 40 μl。
H2O 0.8倍體積
10X限制性內切核酸酶緩沖液 0.1倍體積
無 DNase 的 RNase 10 μg/ml
使用前每 40 μl 混合物加入 10 個單位限制性內切核酸酶。
11. 用多通道移液器在每個孔中加入 40 μl 限制性內切核酸酶反應混合物。反復抽吸數次使孔中內容物混合，小心避免產生氣泡。按步驟 3 用 Tupperware 容器制作濕盒, 將培養板放入，使反應在適宜的消化溫度溫育 12~16 h。
12. 加入 5~10 μl 蔗糖凝膠上樣緩沖液終止反應，進行 Southern 印跡和雜交以分析消化的 DNA。以上就是本期的內容，更多資訊，歡迎關注安培生物科技有限公司了解更多技術與產品資訊。
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