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CAT活性的層析分析法

發(fā)布時間： 2021-12-14　　點擊次數(shù)： 1581次

材料與儀器
DNA
PBS 乙酸乙酯氯仿甲醇 Tris·Cl
薄層層析缸濾紙離心管離心機
步驟
1. 100 mm 培養(yǎng)皿中的轉染了CAT表達質粒的貼壁細胞，用PBS洗兩次，每次5 ml每培養(yǎng)皿加入1 ml TEN溶液。將細胞置于冰浴5 min。

2. 用橡膠細胞刮子將細胞從培養(yǎng)皿上刮下來，將其轉入一只1.5 ml 的微量離心管中，置于冰浴5 min。

3. 在4℃以最大離心速度離心細狍1 min，細胞沉淀重懸于100 μl 冰冷的0.25 mol/l 的pH7.5的Tris·Cl緩沖液中。

4. 在干冰/乙醇中凍結細胞5 min，移至37℃融解5 min。重復這種凍融過程兩次以上。

5. 在冰上冷卻細胞裂解液，然后，4℃以最大離心速度離心5 min。移出并保留上清（細胞提取物），置于- 20℃凍存。

6. 在下面混合液中分析20 μl 細胞提取液
2 μl 200 μCi/ml ［14C］氯霉素
20 μl 4 mmol/l 乙酰輔酶A
32.5 μl 1 mol/l Tris·Cl，pH7.5
75.5 μl H2O

7. 對于每組分析，在微量離心管中加130 μl 上述混含液和20 μl 提取液，輕輕混勻。 37℃溫育1 h。

8. 加1 ml 乙酸乙酯至反應液中，在漩渦混合器上混勻。離心1 min，移出上層液相（乙酸乙酯）在Speedvac蒸發(fā)器中蒸干乙酸乙酯45 min。

9. 薄層層析缸的平衡：在缸中加入190 ml 氯仿，10 ml 甲醇，及一張與TLC薄層平板大小大致相等的Whatman 3MM 濾紙，靜置2 h。

10. 將毎個樣品重懸于30 μl 乙酸乙酯中，點樣，在TLC薄板邊緣之上約2 cm 處，每樣5 μl。

11. 在盛有200 ml 19：1氯仿/甲醇的平衡過的層析缸中展開色譜，進行2 h 或至溶劑的前沿接近薄板的頂部為止。取下TLC薄板，在空氣中晾干。用放射性墨水筆作上標記后，用塑料薄膜包裹，置于感光片上進行放射自顯影。

12. 切出各顯影點相應的薄層塊放入閃爍液中計數(shù)，先測定出各單乙酰氯霉索的計數(shù)值所占的百分數(shù)而計算提取物的活性，按下列公式計算的活性：

同實驗其他方法
原位裂解細胞的CAT分析法
1. 60 mm 培養(yǎng)皿中轉染了CAT表達質粒的細胞，用2 ml PBS洗1次。每培養(yǎng)皿加入2 ml 低滲緩沖液，在室溫下溫育2~5 min。 2. 吸去低滲緩沖液，加入400 μl T
CAT活性的相-抽提分析法
一、來源于哺乳動物細胞 1. 按“CAT活性的層析分析法"中的步驟1~5的凍融法，制備哺乳動物細胞提取物。如果用胰蛋白酶消化或制細胞方法來收集細胞，則將原位裂解法的步驟1至4用以下的步驟2
人生長激素的放射免疫分析法
1. 取轉染了hGH表達質粒的哺乳動物細胞的培養(yǎng)液100~500 μl。 2. 加100 μl 培養(yǎng)液或標準品至12 mm×75 mm 圓底試管中。加入100 μl 125I-
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