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大鼠大腦皮層神經元細胞培養實驗——酶消化法
發布時間： 2021-12-05 點擊次數： 1855次材料與儀器
小鼠
酒精 解剖液 胰蛋白酶 DMEM F12 B27 阿糖胞苷培養液
培養箱步驟
一、小鼠大腦皮層神經元原代培養步驟
1. 于無菌條件下切取鼠頭并以75%酒精浸泡1 min，解剖出完整鼠腦。
2. 預冷解剖液中分離去除軟膜、血管、取大腦皮質漂洗，用眼科剪將皮質反復剪切成碎塊。
3. 移入培養皿中，吸除解剖液加入0.25%胰蛋白酶2 ml，37℃培養箱中消化30 min。
4. 將皮層組織碎塊移入離心管，棄去剩余消化液，用接種液洗3次，每次洗滌后使組織塊充分沉降到試管底，棄去上清液。
5. 最后再用接種液1 ml混懸，反復吹打（巴氏吸管）混懸液中組織塊，力度適中，至渾濁后將上清液移入培養瓶待用。
6. 加入1ml接種液后再次吹打，如此反復3-4次，組織塊逐漸消化后，棄去最終殘塊。
7. 收集含單細胞懸液的上清液約4-5 ml于培養瓶中，以接種液重新懸浮細胞，細胞記數；接種1x107個細胞于6孔培養板中。
8. 培養24 h至細胞貼壁后，換全培養液（DMEM/F12+2%B27）培養3d，觀察神經元生長狀況。
9. 換用阿糖胞苷培養液、 每隔3d換全培養液1次，每次換半液。
二、神經元免疫化學鑒定
1. 4%多聚甲醛固定細胞30 min，PBS洗滌3次。
2. 加入無水甲醇:30%雙氧水（5:1）處理30 min，PBS洗滌3次。
3. 加入5%羊血清封閉20 min，棄去多余液體。
4. 加入Rabbit Anti-NSE（1:100）（神經元特異性烯醇化酶），培養箱中孵育2-4 h，PBS洗滌3次。
6. 加入DAPI染液（1:40），室溫放置5-10 min；PBS洗滌3次。
7. 熒光顯微鏡觀察。
三、結果
圖1： 剛接種時細胞圖
圖2： 剛接種時細胞圖培養1d后
圖3： 剛接種時細胞圖培養2d后
圖4： 剛接種時細胞圖培養3d后
圖5： 剛接種時細胞圖培養4d后
圖6： 剛接種時細胞圖培養5d后
圖7： 剛接種時細胞圖培養6d后
圖8：第7d免疫鑒定圖
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