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背根神經節細胞的原代培養實驗步驟
發布時間： 2021-11-08 點擊次數： 2584次材料與儀器孵化8-12d的雞胚。孕15d及新生1-3d的大、小鼠仔鼠
含10%胎牛血清的DMEM培養基 神經元維持培養基(Neurobasal+B27+谷氨酰胺+20ng mlNGF) 10µM阿糖胞苷(ARA-C)
培養瓶實驗步驟獲得消毒動物后詳細的步驟如下：
1．無菌條件下仰臥放置胚胎或仔鼠于冰D-PBS液中，斷頭后打開胸腹腔，除去內臟器官。從頸部椎管開口插入顯微剪，沿脊柱背側中線兩側剪開椎管，去除暴露脊髓后，即在椎間孔旁可見到沿脊柱兩側排列的背根節，用精細顯微攝小心提取，并剝除其被膜。
2.若施行組織塊培養，可用精細顯微剪將每個背根節剖為2-3個植塊，直接接種于涂有鼠尾膠的基質上，加少量含10%胎牛血清的DMEM培養液培養。
3.如若需要背根神經節分散細胞培養，則可將分離好的DRG組織塊收集入0.25%胰蛋白酶液中37℃消化30min。加人10滴胎牛血清終止消化后，900r/min離心5min,去除上清。而后依照總論的方法在含10%胎牛血清的DMEM培養液中制成單細胞懸液，調整細胞濃度為(0.5-1)X105/ml接種細胞于多聚賴氨酸包被的介質上，37℃,5%CO2的孵育箱內培養。
4.以上兩種培養方法24h后均傾去培養皿內種植培養液，改用無血清培養液(Neurobasal+827+谷氨酰胺+20ng/ml NGF)培養。接種第3天，加入細胞分裂抑制劑ARA-C以抑制非神經細胞的增殖，作用48h后半量更換新鮮培養液，以后每周1/2量換液2次。
5.純化培養的DRGs可以存活2個月之久，純度可達96%以上。分散培養的DRG神經元48h可見胞體有光暈感，圓形或橢圓形，大小不一，有多極、雙極和假單極神經元。2d后給予抑制劑處理后，DRG突起生長迅速，形成稀疏網絡狀結構。隨著培養時間的延長，神經元突起的主干和分枝明顯延長并增粗，神經突起網絡變得更加致密，雜質細胞已經脫壁漂浮，培養物背景變得干凈清晰很多，免疫細胞化學進一步鑒定培養細胞為神經絲(NF)陽性（圖1-3)。
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