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搞定內(nèi)參，駕馭 Western blot 已成功一半

發(fā)布時間： 2021-09-15　　點擊次數(shù)： 1727次

western blot 對絕大多數(shù)實驗新人而言，絕對是心中痛，一碰就要抓狂。沒辦法,誰讓導(dǎo)師發(fā)話了，WB 做不好，延畢就是分分鐘的事兒。這還真是讓小伙伴們感嘆道，WB 想說愛你不容易。那么為了*馴服 WB，獲得漂亮且理想的實驗結(jié)果，一個良好的參照體系就絕對是*的存在。
一般而言，良好的參照體系包括：
*體重計（分子量 marker）：可確定蛋白條帶對應(yīng)的分子量大小
*光桿司令（空白對照）：不加一抗和二抗，用于檢測膜的性質(zhì)的封閉效果
*好榜樣（陽性對照）：已知量標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)物的正對照，可檢測抗體的工作效率

*打醬油的（陰性對照）：不表達(dá)靶蛋白的組織或樣品，檢測抗體的特異性
*單飛者（二抗對照）：不加一抗，檢測二抗的特異性。
*校正者（內(nèi)參對照）：檢測標(biāo)本系統(tǒng)和抗體系統(tǒng)，減少蛋白定量、上樣過程中的誤差

內(nèi)參君的初次登場
在此，小編就帶領(lǐng)大家一起來認(rèn)識認(rèn)知這位“有名"的內(nèi)參君吧。內(nèi)參（Internal Control），簡而言之，一般指的是由管家基因編碼表達(dá)的蛋白（Housekeeping Proteins），因其表達(dá)恒定被用于檢測蛋白表達(dá)水平變化時的參照物，可確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

Tips:
1）在一些文獻(xiàn)報道中，Erk2、TATA bindingprotein(TBP)以及 c-Jun、c-Fos 等也可被用于核蛋白的內(nèi)參。
2）內(nèi)參的選擇需要考慮實際的實驗環(huán)境。
eg：在細(xì)胞增殖相關(guān)試驗中，c-Jun 由于自身表達(dá)變化就不適合做內(nèi)參;而在凋亡實驗時，TBP、Lamin 等也不適合作為內(nèi)參。因此設(shè)計實驗方案的時候應(yīng)該考慮這些因素并查詢相應(yīng)文獻(xiàn)，在實驗過程中也應(yīng)該注意如果內(nèi)參表達(dá)出現(xiàn)異常，應(yīng)考慮這方面因素。

鋒芒畢露的內(nèi)參君
正所謂，養(yǎng)兵千日，用在一時。可是很多實驗菜鳥在選好內(nèi)參之后，對下一步如何發(fā)揮內(nèi)參君的本領(lǐng)感到一愁莫展。那么以下三個妙招可一解大家的燃眉之急。
1、超級簡便的標(biāo)記內(nèi)參使用法：只要在二抗孵育時加入 HRP 標(biāo)記內(nèi)參抗體，按照正常操作即可。
2 、普通內(nèi)參：當(dāng)目的蛋白的分子量大小與選用的內(nèi)參蛋白分子量相差不大時，可以*行目的蛋白的抗體溫育顯色和檢測。然后使用膜再生液（P1650）洗掉膜上的抗體，重新進(jìn)行內(nèi)參蛋白的抗體溫育、顯色檢測。
3 、當(dāng)目的蛋白的分子量大小與選用的內(nèi)參蛋白分子量大小相差比較明顯情況下，可以在轉(zhuǎn)膜后預(yù)染，根據(jù)蛋白質(zhì) Marker 的大小將膜剪為大分子量和小分子量兩部分，使內(nèi)參蛋白與目的蛋白分開。然后兩塊膜分別與內(nèi)參蛋白抗體以及目的蛋白抗體進(jìn)行溫育，二抗溫育以及顯色。如此下來，各位小伙伴就可以坐等鋒芒畢露的內(nèi)參君為我們擒獲漂亮且理想的內(nèi)參圖片。

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