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蛋白樣品的制備與定量

發(fā)布時間： 2021-09-14　　點擊次數(shù)： 3154次

（1）提細胞蛋白
① 消化或刮下細胞至 1.5 的 EP 管中，標記，10000r 離心 2min，PBS 洗 3 遍
② 吸去 EP 管中 PBS，最好用濾紙吸干里面的水分，加適量 RIPA 裂解液（RIPA 裂解液：蛋白酶抑制劑=250:1），如果你想做信號通路指標還得再加上磷酸酶抑制劑（磷酸酶抑制劑： RIPA 裂解液=1:1000）
③ 冰上裂解 30min~1h，開 4°離心機
④ 4°離心 11000r，20min
⑤ 測蛋白濃度，取上清，加蛋白上清的四分之一體積 5x 上樣 loading buffer，煮沸，分裝（蛋白質(zhì)變性）

（2）提組織蛋白
① 研缽中倒入液氮，加入組織塊，研磨，加液氮，藥匙刮
② 刮下后放入 1.5ml 的 EP 管，加適量裂解液，吹打
③ 冰上放置 1h，期間，每隔 10~15min 吹打一次，開 4°離心機
④ 4°離心 10000r，1h
⑤ 測蛋白濃度，取上清，加 1/4 體積 5x loading buffer，煮沸，分裝

（3）測蛋白濃度（BCA 法）
① 八個標準孔，按說明書先加超純水，再加標準蛋白液
② 目的孔，每孔加 18ul 超純水+2ul 目的蛋白
③ 按說明書配 BCA 工作液，每孔加 200ul
④ 37°放置半小時后測濃度

（4）計算上樣量，設(shè)計上樣順序
上樣體積：上樣量/濃度 x 5/4
上樣順序：無處理，對照，處理；體積最好不要相差太大

經(jīng)驗總結(jié)：
如何提高蛋白濃度：首先當然是多種點細胞啦，其次可以少加點裂解液，盡量裂解充分。如何處理蛋白濃度低的問題：實驗過程中發(fā)現(xiàn)蛋白的濃度太低，如果上樣的話，體積太大，甚至電泳孔都裝不下，舉例：假設(shè)我需要上樣 40ul 才能達到 20ug，那么顯然按照常規(guī)的方法，10 孔的梳子只能加 25ul 左右，我們此時可以取 40ul 蛋白入 EP 管中，放置于 PCR 儀器，變性溫度濃縮蛋白體積，這樣不斷濃縮之后促使 EP 管中蛋白的水分降低，蛋白量依舊是 20ug。如何保證對照組和實驗組蛋白濃度大概是一致的：種植細胞的時候盡量保持鋪下去的細胞數(shù)接近，收細胞之后觀察細胞的多少適當加入幾倍體積的裂解液。

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