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染色質免疫共沉淀值得注意的15個細節
發布時間： 2021-09-13 點擊次數： 2746次染色質免疫共沉淀，又叫 Chip（Chromatin Immunoprecipitation）。Chip 又正好是英語里面薯片的意思。為了有趣，就叫薯片實驗吧。做薯片做了幾個月，時間不長，但深刻體會到了魔鬼都在細節中和細節決定成敗。現在把值得注意的 15 個細節總結如下：
1、cell counting：盡量做到準確準確再準確，否則會影響 input 結果。
2、cross link：甲醛的終濃度是 1%，這個基本所有的 protocol 上都會強調。
3、resuspend cells with SDS:一定要選用小的 tip 頭，在液面下吹打，否則很容易產生氣泡，后面的 sonication 就麻煩了。
4、sonication：Chip 實驗中最重要的一部分，合適的條件要自己摸索，可以一次嘗試不同次數的 sonication，然后建議采用 EZ-ChIP 上推薦的方法看看 sonication 的效果如何。
5、加入 salmon sperm DNA/Protein A or G 之前要先混勻，因為 salmon sperm DNA 是很粘稠的物質，若不混勻，后面你會發現 beads 的量不一樣，自然也會影響實驗的結果。
6、wash 的時候前面幾個步驟可以不用洗的太干凈，但最后一個要盡量吸干凈，必要時可用 gel loading tips 吸。
7、含 beads 的 samples 離心時，有的 protocol 上推薦是 1000rpm，45 秒，但可以根據情況調整，但要注意轉速不能太快防止 beads 破碎。（當然如果采用的是 magnetic 的 beads 就不存在這個問題）
8、reverse crosslink 可以是 65°C 4 個小時，也可以 overnight。
9、reverse crosslink 后的在進行下面步驟之前建議先離心，把蒸發到離心管蓋子上的部分離下來。
10、每次行 real time PCR 之前都要把 sample 離心保證取樣的準確。
11、1~10ul 的槍取 3ul 以上才比較準確，所以考慮好自己 PCR 反應體系的配置。
12、一個 Chip 實驗一般需要 3~4 天的時間。但是，其中有幾個步驟是可以中途停下來的。畢竟，誰也沒有辦法不眠不休地連續 3、4 天一口氣做完。下面是幾個可以停下來喘口氣的地方：
（1）細胞收集：用含蛋白酶抑制劑的 PBS 洗滌離心，去上清的細胞收集液可置-80°C 凍存；
（2）用 SDS 重懸細胞后可置-80°C 凍存；
（3）sonication 結束，離心后的上清置新的離心管后可-80°C 凍存；
（4）reverse cross-link 后的標本可-80°C 凍存。凍存后就可以該干啥干啥去了。想接著做的時候，拿出來解凍就可以啦。
13、agarose beads 的 wash 過程中以及后面的 DNA 提取過程中乙醇的 wash，可以用細胞室的那種吸引器，接上 200ul 的 tip 頭吸，這樣會節省很多時間（每個實驗室情況可能不一樣）。
14、DNA 提取后建議用水溶解 DNA，因為 TE buffer 里的 EDTA 可能會影響 PCR 反應體系中的 Mg2+。
15、溶解 DNA 的水量可以根據 PCR 反應體系的要求適當調整。
綜上所述，我們探討了做 Chip 實驗需要注意的 15 個小細節。細節雖小，但是卻很重要。需知魔鬼都是在細節中！
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