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【干貨】RNA抽提原理和流程

發(fā)布時間： 2021-08-30　　點(diǎn)擊次數(shù)： 7071次

現(xiàn)在我們所熟知的 TRIzol 是 Life Technologies 公司的商品名，而同樣的試劑在 Piotr Chomczynski 創(chuàng)辦的 MRC 公司則被命名為 RNAzol（據(jù) Piotr Chomczynski 透露，他們已經(jīng)將 RNAzol 改進(jìn)，使抽提得到的 RNA 無基因組 DNA 殘留）。事實(shí)上，這種 RNA 抽提的方法應(yīng)該叫做“異硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法"。

TRIzol 作用原理：
在勻質(zhì)化或溶解樣品中，TRIzol 試劑可保持 RNA 的完整性，同時能破壞細(xì)胞及溶解細(xì)胞成分。加入氯仿離心后，裂解液分離成水相和有機(jī)相。RNA 存在于水相。水相轉(zhuǎn)移后，RNA 通過異丙醇沉淀回收。移去水相后，用乙醇沉淀可從中間相得到 DNA，加入異丙醇沉淀可從有機(jī)相得到蛋白質(zhì)。

需自備的耗材試劑：
o RNase free 的一次性帶蓋透明聚丙烯管
o RNase free 的槍頭
o RNase free 玻璃瓶：玻璃瓶 200°C 烘烤 2h 即可去除 RNase，塑料瓶蓋可浸泡 10 分鐘的 0.5 M NaOH 溶液，然后用 RNase free 水*沖洗，并高壓蒸汽滅菌。
o 氯仿
o 異丙醇
o RNase free 水：即 DEPC treated 水。把水加入 RNase-free 玻璃瓶中，加入 0.1%（v/v） DEPC 用力搖勻，37°C 過夜，高溫高壓滅菌。滅菌時瓶口需擰松，DEPC 受高溫會分解出大量 CO2，注意安全！
o 75%乙醇（無水乙醇溶于 RNase free 水中）

簡明抽提流程：
裂解
a) 新鮮取材的組織液氮急凍后，每 50-100mg 組織加 1ml TRIzol，使用強(qiáng)力勻漿機(jī)勻漿；
b) 貼壁細(xì)胞則棄培養(yǎng)基后每 87.5px 皿中加入 TRIzol 試劑 1ml 吹打裂解；
c) 懸浮細(xì)胞則離心沉淀細(xì)胞棄培養(yǎng)基，每 5-10×106 個細(xì)胞中加入 1ml TRIzol 吹打裂解。
Tips：使用 TRIzol 試劑前避免洗滌組織和細(xì)胞，因?yàn)檫@增加了 mRNA 降解的可能性。
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室溫孵育 5-10min
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每 1ml TRIzol 中加 200ul 氯仿，用手大力搖管 15s，室溫孵育 2-3min
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2-8°C、12000 g×15min

離心后，混合物分離為下層紅色的酚-氯仿相、中間相以及上層無色水相。RNA 存在于水相。
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轉(zhuǎn)移水相到一個新管，加入 500ul 異丙醇上下顛倒混勻，室溫孵育 10min
Tips：轉(zhuǎn)移水相時，槍尖隨著液面下移而下移，避免擾亂分層，慢慢吸取，避免吸到中間相和下層有機(jī)相，更不要貪心吸太多，吸大約 400ul 就好。
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2-8°C、12000 g×10min 往往離心前 RNA 不可見，離心后再管側(cè)面和底部形成白色沉淀
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棄上清，1ml 75%乙醇洗滌一次，2-8°C、7500 g×5min
Tips：加入 75%乙醇時輕輕加進(jìn)去就好，盡量不要把 RNA 沉淀吹散，把沉淀保持在原位最好了，因?yàn)橛袝r候 RNA 太少，吹散了再離心下來時 RNA 碎片不一定能聚集到一起形成肉眼可見的沉淀，導(dǎo)致后面的“盲操作"。而不小心吹散的話也沒關(guān)系，對 RNA 質(zhì)量不會有影響。
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盡量吸除上清，室溫干燥 5-10min，以 RNase free 水溶解，并保存于-70°C
Tips：密切注意 RNA 沉淀的干燥程度，不要*干燥，這將大大降低其溶解度。部分溶解的 RNA 其 A260/280 比值會偏低。最佳干燥度為 RNA 沉淀仍然是白色的，微微濕潤呈啫喱狀。

OK，搞定！

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