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你真的了解 TA 克隆嗎？
發布時間： 2021-08-25 點擊次數： 3005次首先，TA 克隆是用于 PCR 產物的克隆和測序。原理是利用 Taq 酶能夠在 PCR 產物的 3’末端 加上一個非模板依賴的 A，而 T 載體是一種帶有 3’T 突出端的載體，在連接酶作用下，可以快速地、一步到位地把 PCR 產物直接插入到質粒載體的多克隆位點中。
那么在你做 TA 克隆時，需要準備的前期工作是什么呢？
1 、設計引物 P 出你的目的基因
不管你是手動設計還是軟件設計或是直接引用別人已經發表文章用到的引物，只要能 P 出 來目的片段就行，在 PCR 的結果中需要注重 P 出來的濃度，要達到濃度高的要求一方面是在前期的樣本準備本身就得到高濃度。
比如要 P 出一種病毒的某部分基因，那么在病毒的 RNA 提取時，就必須保證該病毒的病變效果明顯，才有可能得到高濃度的 RNA，繼而或者逆轉錄得到高濃度的 cDNA。
另一方面是在 PCR 的條件時對于退火溫度等的條件把握，如果有一些引物二聚體存在，那么可以嘗試提高退火溫度，延長一點延伸時間，但具體如何使得 PCR 跑出來又亮又單一，還是需要摸摸條件。
2 、切膠回收產物
在紫外儀下切下目的產物，注意一定要快準狠，盡快切下，并盡可能少的切下多余的膠，回收利用的試劑盒一般嚴格按照試劑盒操作應該沒有什么問題。回收之后測濃度，準備下一步。
3 、連接
這一步驟就直接按照選擇的 T 載體說明書來操作了，需要注意的是，在上一步測完回收濃度后，如果濃度較低，建議在試劑加量上盡量加大 DNA 的用量。
一般來說回收之后就趕緊地進行連接，但是由于有時候可能中間時間耽誤了，沒能及時連接， 那么在這之前可以補加兩個步驟，一是加 A 尾，二是純化回收的產物。
但是在長期的嘗試中，我發現純化與否和手動加 A 尾并不怎么影響連接效果。
4 、轉化鋪板
這個步驟用來篩選重組子，長出來的菌多不是好事，菌少也不是壞事，也許就只長兩個單克隆菌，但這兩個都是陽性重組子，反正只要挑到正確的就行。
5 、菌液 PCR 鑒定
一般挑菌之后在 EP 管中搖個 3 到 5 個小時就可以進行菌液 PCR 了，一般來說這樣的搖菌時間能最保證接近真實的陽性結果，菌液 PCR 之前有人建議說要煮沸幾分鐘再 P，但其實直接取搖菌的 1ul 作為模板，進行 PCR 就可以了，條件與之前 P 產物的條件一致。
6 、酶切鑒定
酶切位點的選擇必須要確保目的基因中沒有這個位點，而載體與目的基因連接附近有位點。在進行酶切的時候是要摸酶切時間的，是否已經切開跑一個電泳看看。
7 、測序鑒定
如果實在是覺得上面兩個鑒定都拿不準，那也可以嘗試測序，如果測序結果與目的基因能夠*比對匹配上，那么也說明就是連接上了。
其實 TA 克隆是非常簡單的克隆，先天的條件 A 和 T 都已經具備了，除非你手實在不順，連個 2500bp 以下的都是沒什么問題的。
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